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溶溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

溶菌酶主要由吞噬细胞合成并分泌的一种粘性蛋白，属乙酰多糖酶。存在于唾液、乳液泪液和鼻及气管等分泌物中，能溶解革兰氏阳性细菌。由于它的高等电点（PH 11），使它能与细菌牢固结合，并水解细菌细胞壁肽聚糖，使细菌裂解死亡。测定其在血清、体液或分泌物中的含量及其变动情况可作为了解机体防御功能的一个侧面指标。

• 快速简便：全程约2分钟，可测4例左右样本(自身对照法)。
  
• 取样量微：本法取样本量约100μL。
  
• 稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。
  
• 再现性好：变异系数CV=1.7%。
  
• 回收试验：X =96%。
  
• 受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。
  
• 测试面广：可测动物血清（浆）、唾液、乳液、泪液和气管分泌物以及各种水产品等。

• 分光光度计（比色测定波长为530nm）
  
• 恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）
  
• 台式离心机
  
• 漩涡混匀器
  
• 微量移液器

• 贮备菌液的配制：
  取5mg/支的菌粉1支，倒入匀浆管中，加菌粉溶剂1mL，轻轻缓慢上下旋转研磨3分钟(切勿溅出)，即为贮备菌液，将其取出后置2～8℃冰箱密封保存一周左右。
  
• 应用菌液的配制：
  按贮备菌液:菌粉溶剂=1:19进行配制，需多少配多少。剩下的应用菌液2～8℃可保存一周左右。最好是现用现配，用时摇匀。
  
• 标准品贮备液的配制：
  每支准确加双蒸水1.0mL配成2mg/mL的标准品贮备液。2～8℃可保存7～10天。
  
• 标准品应用液的配制：
  临用时按标准品贮备液:双蒸水=1:799比例稀释成2.5μg/mL(即200U/mL)的标准品应用液，需多少配多少。2～8℃保存，可保存7～10天。

• 菌粉尽量研磨碎、磨匀，研磨时防止菌液溅出。
  
• 菌液、标准品、样本必须先在0℃冰水浴预冷5分钟以上。37℃水浴前的操作最好在冰水浴中进行。
  
• 为了避免检测误差，空白管单独用一个比色皿比色，每次加样前或比色前比色杯要先用自来水冲洗干净，再用双蒸水冲洗2-3遍。
  
• 比色时各管从冰水中逐个取出比色。比色皿过冷会在皿壁上形成水雾，所以要擦干再比色。
  
• 试管要用同一批次。
  
• 为了减少误差1cm光径的比色皿也要进行校正。
  
• 比色与计时要同步，准确控制时间。最好为两个人或者用自动生化分析仪。

• 操作步骤：
  
  • 将配制好的应用菌液，标准应用液及所需检测的样本均放入37℃水浴箱中预温5分钟以上。使菌液，标准液及检测样本的温度达到37℃。
    
  • 将可见分光光度计于530nm处，1cm光径比色皿，以双蒸水调透光度100%(比色皿准备两只，一只用于调透光度100%，一只用于测定)。
    
  • 往相应编号的试管中加入0.2mL待测样本，取2mL应用菌液迅速冲入试管中，立即混匀并计时。(标准品应用液取0.2mL，加入2mL应用菌液，其它操作与测定管相同)
    
  • 迅速倒入比色皿中在可见分光光度计530nm处比浊，15秒时读取透光度值T₀，比色皿不要取出，在2分5秒时读取透光度值T₂；
    
  • 求出2次透光度的差值(△T=T₂-T₀)。
    注1：用同一比色皿每检测一个样本后均要用双蒸水冲洗干净，才可再放第二个样本或标准品应用液。
    注2：当测定管△T＞15时，将样本稀释后再测。
• 计算公式：
  

  溶菌酶含量 (μg/mL)	＝	△T测定	×C标准×N
  		△T标准

  
  C_标准：标准品浓度2.5μg/mL
  N：样本测试前稀释倍数
  
• 计算举例：
  
  • 取唾液用生理盐水1:1稀释后，取0.2mL按步骤操作进行检测，测得测定管透光度T₀值为19.1，测定管透光度T₂值为21.3，标准管透光度T₀值为30.0，测定管透光度T₂值为33.5，标准管浓度为2.5μg/mL，则计算如下：
    

    溶菌酶含量 (μg/mL)	＝	21.3－19.1	×2.5×2
    		33.5－30.0
    	＝	3.14μg/mL
    	＝	251.43U/mL

    
    
  • 取罗非鱼血清原液0.2mL按步骤操作进行检测，测得测定管透光度T₀值为11.9，测定管透光度T₂值为16.3，标准管透光度T₀值为26.4，测定管透光度T₂值为29.5，标准管浓度为2.5μg/mL，则计算如下：
    

    溶菌酶含量 (μg/mL)	＝	16.3－11.9	×2.5×1
    		29.5－26.4
    	＝	3.548μg/mL
    	＝	283.87U/mL

    
    
  • 鱼肝脏匀浆的溶菌酶测定
    ① 样本前处理
    取鱼肝脏称重，按肝重量:生理盐水体积=1:9制成5%组织匀浆。然后将制得的匀浆8000-10000r/min，离心10～15分钟，离心后透光度上层脂肪较多，可用棉签将脂去掉，吸取中间较澄清液体(仍有浑浊)进行检测。
    ② 按步骤操作进行检测，测得测定管透光度T₀值为21.7，测定管透光度T₂值为24.5，标准管透光度T₀值为26.7，测定管透光度T₂值为29.6，标准管浓度为2.5μg/mL，5%匀浆蛋白含量为4.203mgprot/mL.则计算如下：
    

    溶菌酶含量 (μg/mgprot)	＝	24.5－21.7	×2.5÷4.203
    		29.6－26.7
    	＝	0.574μg/mgprot
    	＝	45.94U/mgprot

• 按下表加入各成分：
  

  成分	空白管	标准管	测定管
  双蒸水(mL)	0.2
  2.5μg/mL溶菌酶标准应用液(mL)		0.2
  样本(血清、尿、稀释的唾液等)(mL)			0.2
  应用菌液(mL)	2.0	2.0	2.0

  
  注：操作最好在冰水浴中进行，冰水浴即自来水加几块冰。
  
• 混匀，37℃准确水浴15分钟，立即取出置于0℃以下的冰水浴中3分钟，逐管取出倒入1cm光径比色皿中，530nm处以双蒸水调透光度100%，比色，测各管透光度T₁₅(T₁₅即37℃水浴15分钟后的透光度值)。
  注：
  ① 比色时可能在比色皿表面有水雾形成，请将比色皿擦干净后再比色。
  ② 测试过程中为消除每只测定管之相互间的干扰，所以必须在每支管子测定前将比色皿用双蒸水冲洗干净。
  ③ 测定管T₁₅－空白管T₁₅值大于15时，请将样本稀释后再测。
  
• 计算公式：
  

  溶菌酶含量 (μg/mL)	＝	测定管T15－空白管T15	×C标准×N
  		标准管T15－空白管T15

  
  C_标准：标准品浓度2.5μg/mL
  N：样本测试前稀释倍数
  
• 计算举例：
  取唾液用生理盐水1:1稀释后，取0.2mL按步骤操作进行检测，测得空白管透光度T₁₅值为29.8，测定管透光度T₁₅值为44.7，标准管透光度T₁₅值为58.1，标准管浓度为2.5μg/mL，计算如下：
  

  溶菌酶含量 (μg/mL)	＝	44.7－29.8	×2.5×2
  		58.1－29.8
  	＝	2.63μg/mL
  	＝	210.6U/mL